一、细胞永生化介绍、

  细胞永生化（Cell immortalization）是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡。利用基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，从而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的。对细胞永生化进行深入研究，不仅有利于我们了解细胞增殖与衰老的分子机制，而且为探寻肿瘤治疗及器官移植的研究奠定了坚实的基础。此外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。

二、永生化细胞株的建立方法

  由于体外培养细胞自发性永生化率非常低，目前普遍采用基因转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞内, 以增加永生化。永生化相关的外源基因。

以SV40过表达慢病毒为例：

1．转染

（1）将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，

（2）第二天，待细胞贴壁后，换液，

（3）加入1mL完全培养基，再加20 μL SV40过表达慢病毒，

（4）混匀后继续培养，

（5）12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，

（6）当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。

2.筛选

2.1杀灭曲线的确定

（1）将未转染的干细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）将含不同浓度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

结果：嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为3d。

2.2嘌呤霉素筛选转染细胞

（1）第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜

（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，

（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的筛选培养基，孵育，

（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，

（5）每天观察细胞的存活比例，

（6）在同一时间点（3d）存活的细胞，即为转染成功的细胞，

（7）对筛选后的细胞进行扩增。

三、询价及订购

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