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大肠菌群平板计数法

 本法参照国标GB 4789. 3-2010规定的大肠菌群测定方法第二法。

⒈检验程序见图3-7
 
⒉原理

样品先经过VRBA琼脂平板的筛选,因其中含有胆盐和结晶紫,可以很好的抑制革兰氏阳性菌的生长,乳糖可以产酸,在中性红存在时,产生典型的紫红色周围有红色胆盐沉淀的菌落。因为其他阴性肠杆菌可以分解其他糖类产生红色菌落,因此需接种BGLB培养基证实。

⒊操作步骤

样品处理及稀释同MPN法。

①加样制作平板:选取2-3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿ImL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15 -20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注.于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3~ 4mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于(36±1)0C培养18~24h.

②平板菌落数的选择:选取菌落数在15 ~150CFU的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0. 5mm或更大。

③证实试验:从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,(36±1)℃培养24-48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

④大肠菌群平板计数的报告:经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8. 3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(每毫升)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)=6. 0 X 10一3 CFU/g(mL)。

⒋检验时应注意的事项

①检验步骤

2008版前的大肠菌群的检验步骤采用三步法(乳糖胆盐发酵试验、EMB琼脂分离培养和证实试验)。第一步乳糖发酵实验是样品的发酵结果,不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性管,经过平板分离和证实试验后,有时可以成为阴性。大量的数据表明,食品中大肠菌群检验步序的符合率,初发酵与证实试验相差较大,不同食品三步法的符合情况也不一致,所以2008版之后改为两步法,取消了分离培养这一步,将大肠菌群MPN计数法的培养基由乳糖胆盐修改为月桂基硫酸盐胰蛋白膝肉汤;复发酵培养基由乳糖发酵肉汤改为亮绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤,大肠菌群MPN法中报告每100mL (100g)改为1mL(1g)。试验证实,修改后对大肠菌群的检出效果相同,发酵管对于阳性结果的判断只通过“产气”,不存在颜色的影响,明确了判断依据;减少了步骤,使操作更加简便,结果更接近真实。

②产酸产气原因:在初发酵试验中,能出现产酸产气现象的原因很多,如大肠菌群发酵乳糖产酸产气;两种细菌共同作用发酵乳糖产酸产气,但其中任何一种不能单独发酵;食品中杂菌多时,(多黏芽抱杆菌、浸麻芽抱杆菌、产气荚膜梭菌)发酵乳糖产酸产气;有些非大肠菌群发酵葡萄糖等糖类产酸产气。因此必须做证实试验。

③复发酵结果:从LST产气管接一环到BGLB中进行复发酵,(此时不受样品中非乳糖的干扰进行乳糖发酵,也避免了许多芽抱杆菌的干扰),在BGLB中产气的为阳性,不产气的为阴性。但此法也有缺陷,有时出现假阳性。由于亮绿遇胆盐降低了其活性,有时不能彻底抑制芽抱菌。为避免此缺陷,对BGLB中产气的划线于EMB上,挑典型菌落镜检。

④抑菌剂:在大肠菌群检验中,经常使用的抑菌剂有胆盐、洗衣粉、十二烷基磺酸钠、亮绿、结晶紫、孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌,而有利于大肠菌群的生长和挑选,但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微,称量时稍有误差,即可对抑菌作用产生影响;有的抑菌剂当牌号、规格改变时,也可影响抑菌效果,而需重新测定抑菌的有效剂量,这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件。目前我国在食品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂,猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果,经试验观察无明显差异,可相互替代,但其他胆盐的检验效果则不一致,故不宜相互替代。

目前由于胆盐不易购买,有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠、兔胆盐等替代猪胆盐加入培养基中,这会影响大肠菌群的检验结果,应予注意。因此在2008版的检验标准中改为月桂基硫酸钠。两者的作用都是抑制革兰氏阳性球菌。但前者是化学试剂,批间差异小,易观察结果,对损伤菌有修复作用,检出率提高,检验结果稳定。后者是生物试剂,取自牛和猪等动物的胆囊,批间差异大,结果可靠性差。另外,在胆盐用量上实验表明1%, 0.5%和0. 25%三个剂量无任何差异,所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量((0. 5%)是适宜的,在称量时稍有误差,亦不致影响大肠菌群的检出。

⑤平板计数法:若样品较脏,使用MPN法较不方便,一般使用结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)在平皿内样品稀释液与VRBA琼脂混合,等到凝固后,另加盖一层VRBA琼脂,以抑制专性需氧菌,从中挑取粉红晕的菌落计数,取30~150个菌落的平板,挑选其中10个有代表性的菌落分别接种到亮绿胆盐发酵管进行鉴定。

⑥挑选菌落:大肠菌群是一群肠道杆菌的总称,大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠埃希氏菌类更为复杂和多样,而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中,为了提高大肠菌群的检出率,应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验中,大肠菌群在VRBA琼脂上典型菌落呈紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0. 5mm或更大。在伊红一美蓝(EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光泽或无光泽的检出率最高;红色、粉红色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面(如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、降起度、湿润与干燥等)虽亦应注意,但不如色泽方面更为重要。影响大肠菌群检出率的因素较多,如食品种类、菌落色择和形态、细菌种类等,所以实际工作中通常挑选一个菌落,由于概率问题,难免出现假阴性,尤其当菌落不典型时。所以挑菌落一定要挑取典型菌落,如无典型菌落则多挑几个,以免出假阴性。

⑦产气量:大肠菌群的产气量,多者可使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说,产气量与大肠菌群检出率呈正相关,但随样品种类而不同,有小于米粒的气泡,亦可有阳性检出。对未产气的乳糖发酵管如有疑问时,可用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应做进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。
⑧MPN法:MPN法是一种采用数学理论推算,用置信区间描述细菌浓度的一种间接计数法。虽然实验结果以MPN值表示,但MPN值并不能表示实际菌落数,而实际菌落数落在置信区间内的任何一点。该方法是1915年McCrady首次发表的。

最可能数(MPN)是表示样品中活菌密度的估测。MPN检索表通常是采用三个稀释度九管法来计算的,当然也可以十五管或更多。稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测,较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性,而最高稀释度的3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数,则做一定范围的稀释度。这次提供的MPN检索表列出了95%可信限,供作参考。

另外,在查阅MPN检索表时,应注意以下几不问题。

通常MPN检索表只给了三个稀释度,即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g),如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g)或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g)时,则表内数字应相应增加或降低10倍,其余可类推。

在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL (g),系指原样品(包括液体和固体)的毫升(克)数,并非样品稀释后的毫升(克)数,如固体样品lg经10倍稀释后,虽加人1mL量,但实际其中只含0. 1 g样品,故应按0. 1g计,不应按1mL计,或按1mL计,单检索数字必须再乘以稀释倍数。

当检索表内三个稀释度检测结果都是阴性时,MPN值应按<3判定,这样更能反映实际情况。例如11. 1mL(g)和1. 11mL(g)两个检测剂量,当它们都是阴性时,如按。处理,则两组样品虽相差10倍,但MPN值却无法区分,实际上这两个。的含义并不相等。如按照<3和<30处理,则MPN值能反映出两组所用样品量的不同,实际上11. 1mL(g)应为G3,而1. 11mL(g)应为<30,二者还是有区别的。所以用<3和<30处理,更能反映实际情况。