细胞复苏、传代与冻存操作流程

一、 仪器与试剂

二、操作流程：

复苏

1) 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

2) 从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入恒温水浴锅中复温，不断震荡冻存管以提高复温速率；

3) 将融化了的冻存管中的用移液管转入一直装有5ml完全培养基的15ml离心管中，充分混匀后，300g离心5min；

4) 离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，再加完全培养基4ml，之后转入CO₂培养箱中培养静置。

传代

1) 将需要那传代的细胞从CO₂培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；

2) 向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；

3) 重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO₂培养箱中孵育1min；

4) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；

5) 向消化下细胞的培养瓶中加入3ml完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；

6) 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬细胞，将重悬后的培养基转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml，提前向每个培养瓶中各加入4ml完全培养基；

7) 水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使细胞均匀分部在培养平面上，然后将培养瓶置于CO₂培养箱中静置培养。

注意：

a) 每次消化不超过2min，如果消化2min后，培养瓶中还有较多细胞贴壁，可采用分步消化，将消化下来的细胞移入15mL离心管中和，再向培养瓶中加入胰酶继续消化，每次消化不超过2min，直到完全消化下来为止。

b) 细胞传代建议1传2。

冻存

1) 将需要那冻存的细胞从CO₂培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；

2) 向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；

3) 重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO₂培养箱中孵育1min左右；

4) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；

5) 向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；

6) 离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；

7) 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

8) 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。